Введение

Методика культивирования клеток нервной ткани in vitro находит широкое применение как при исследовании фундаментальных принципов функционирования нейронов и биологических нейронных сетей, так и при решении ряда практических задач биомедицинского характера, в биоинже- нерных разработках, при экспериментальном моделировании развития па- тологических состояний. Особенностью экспериментальной работы с куль- тивируемыми нейронами является необходимость анализа изображений не только тел клеток, но и сложной сети отростков – нейритов. Для подсчета количества клеток в суспензии при проведении работ по клеточному куль- тивированию часто используются классические подходы с камерой Горяева благодаря их широкой распространенности и простым методикам работы, основанным на ручном подсчете клеток. В целом обработка изображений клеток – это трудоемкая процедура, требующая концентрации внимания и сопряженная с ошибками при больших объемах работ. Вместе с тем в настоящее время интенсивно развиваются методы нейросетевой обработки изображений, которые успешно применяются для распознавания различных биологических объектов. В связи с этим актуальной является разработка методов анализа изображений клеток нервной ткани, полученных методами световой микроскопии, позволяющими проводить исследования динамики живых развивающихся культур клеток. Перспективные подходы в данном направлении связаны с использованием современных методов машинного обучения, в том числе методов глубокого обучения, которые пригодны для работы со сложными и зашумленными изображениями. Так, архитектура нейронной сети U-Net, реализующая метод глубокого обучения, показала хорошие результаты при обработке изображений биологических объектов.

В данной работе представлены подходы к сегментации фазоконтрастных изображений культивируемых нейронов коры головного мозга крысы, а также подсчета клеток в камере Горяева с применением нейросетевых методов глубокого обучения.

Материалы и методы клеточных работ

Нейроны коры головного мозга крысы выделяли в соответствии с нормами этического обращения с экспериментальными животными. Диссоциированные нейроны высевали в чашки Петри Nunclon Nunc (Thermo Fisher Scientific, США) в культуральную среду Neurobasal с добавкой B-27 (Thermo Fisher Scientific, США) и помещали в клеточный CO2-инкубатор при температуре 37 ℃, содержание СO2 в инкубаторе составляло 5%. Изображения нейронов получали при помощи микроскопа Nikon Eclipse Ti2-U (Япония) в режиме фазового контраста путем автоматического сканирования заданной области.

Для получения изображений суспензии клеток в камере Горяева использовали линию глиомы крысы C6. Изображения получали через микроскоп BestScope BS-2092 с установленной цифровой камерой ToupCam UCMOS05100KPA.

Реализация методов обработки изображений

Для предварительной обработки полученных изображений нейронов применяли разработанный набор модулей на языке Python с помощью библиотеки OpenCV. Помимо предобработки данных, изображения из обучающей выборки проходили этапы аугментации, включающие отражение от оси, вращение изображения, размытие области, изменение яркости изображения.

Для решения задачи сегментации была модифицирована модель MEDIAR-Former, разработанная на основе архитектуры U-Net и учитывающая необходимость обработки гетерогенных наборов изображений, которые получены методами оптической микроскопии. Структура MEDIAR-Former в общем виде состоит из блоков кодирования, декодирования и двух независимых выходных блоков распознавания клеток (CR) и разделения клеток (CD). Данная модель была модифицирована путем добавления блоков классификации клеток (CC) и сегментации нейритов (NS).

В качестве метрики результативности использовали F1-меру как среднее гармоническое между точностью и полнотой, где точность – отношение числа истинно-положительных результатов к сумме числа истинно- положительных и ложноположительных результатов, а полнота – отношение числа истинно-положительных результатов к сумме числа истинно-положительных и ложноотрицательных результатов.

Для расчета количественных показателей длины нейритов использовали операцию скелетонизации бинарной маски, в результате чего получали набор линий, для которых рассчитывали длину. Для создания обучающих наборов данных выполняли ручную сегментацию данных на соответствующие классы.

В качестве начального состояния использовали набор весов, полученный в результате обучения с применением ряда открытых баз данных изображений культивируемых клеток, для которого затем проводили дообучение с помощью полученных изображений культивируемых нейронов и соответствующих масок, полученных в результате ручного сегментирования.

Для распознавания клеток глиомы С6 на изображениях камеры Горяева взяли нейросетевую модель на основе архитектуры U-Net c прогнозированием вертикальных и горизонтальных градиентов объектов. Для распознавания использовали базовый набор весов, полученный в результате обучения нейронной сети на наборе изображений клеток из различных источников, а также набор весов, полученный в результате дообучения после ручной сегментации изображений клеток С6 в камере Горяева при увеличении 10х и 20х. В качестве мер эффективности распознавания применяли: точность A как отношение числа правильно распознанных объектов к размеру обучающей выборки; точность P как отношение числа истинно-положительных результатов к сумме числа истинно-положительных и ложноположительных результатов; полноту R как отношение числа истинно-положительных результатов к сумме числа истинно-положительных и ложноотрицательных результатов.

Результаты и обсуждение

Разработанный метод анализа изображений нейронов апробирован при характеризации развития сети культивируемых нейронов in vitro на основе подсчета длины нейритов на различных стадиях роста культуры. Полученная зависимость рассчитанной суммарной длины нейритов на одном квадратном миллиметре поверхности при ручной сегментации соответствует зависимости для ручной сегментации, но рассчитанные значения длины меньше, так как алгоритм распознает не все нейриты, определенные при ручной обработке. При сегментации тестовой выборки были получены следующие значения F1-меры: для клеток и кластеров F1=0,688, для нейритов F1=0,609. Для исходной модели Mediar без дообучения при классификации клеток получено значение F1=0,215. Таким образом, дообучение на полученных фотографиях культивируемых нейронов позволи- ло существенно улучшить производительность сегментации нейронов.

При подсчете клеток на изображениях камеры Горяева при увеличении 20х точность A составила 0,925 при распознавании с базовым набором весов и 0,965 при распознавании после дообучения. При увеличении 10х при  распознавании  с  базовым  набором  весов  получены  значения: A=0,794, P=0,962 и R=0,892. При увеличении 10х при распознавании после дообучения получены значения: A=0,981, P=0,994 и R=0,986. Таким образом, процедура дообучения после ручной сегментации позволила повысить производительность распознавания клеток. Эффективность распознавания изображений при увеличении 10х снизилась по сравнению с изображениями при увеличении 20х в связи со снижением степени детализации объектов. Дальнейшее развитие представленного подхода будет направлено на работу с изображениями, полученными при увеличении 4х, которые захватывают полный сегмент камеры Горяева, что позволит проводить подсчет клеток по одной фотографии и значительно ускорит работу по сравнению с ручным методом. При наборе соответствующих баз данных возможен анализ изображений окрашенных клеток, а также детекция различных типов клеток на основе их морфологических особенностей.

Полученные значения F1-меры при распознавании нейритов сравни-мы со значениями для распознавания клеток, что свидетельствует об эффективности работы выбранной нейросетевой модели при распознавании нейритов по сравнению с классическими методами, основанными на детекции с применением порога интенсивности. Для повышения эффективности распознавания будут проводиться донабор базы данных изображений культивируемых нейронов, используемых для обучения нейронной сети, а также модификация архитектуры для улучшения работы с протяженными объектами. Дальнейшее развитие разработанных средств анализа также может быть направлено на разделение распознанных клеток на классы по морфологическим признакам, например, нейроны и глиальные клетки, при формировании соответствующей базы данных изображений. На основе получаемых в результате сегментации масок возможно проведение подсчета количества клеток на подложке, степени их адгезии к субстрату, морфологического исследования арборизации нейритов и других видов анализа. Полученные результаты могут применяться при отработке новых экспериментальных методик выращивания нейронов, в том числе на новых типах субстратов, для количественного мониторинга прикрепления и адгезии клеток, роста нейритов.

Разработанные методы могут применяться и для анализа изображений, получаемых при проведении других типов экспериментов с культивируемыми клетками, например, при исследовании процессов дифференцировки стволовых клеток в нейрональном направлении, при разработке биоинженерных конструкций для моделирования процессов регенерации нервной ткани, для выявления патологических фенотипов клеток на изображениях, при работе с экспериментальными системами на основе органоидов, моделирующих процессы развития нервной системы.