Уводзіны
Методыка культывавання клетак нервовай тканіны in vitro знаходзіць шырокае прымяненне як пры даследаванні фундаментальных прынцыпаў функцыянавання нейронаў і біялагічных нейронных сетак, так і пры вырашэнні шэрагу практычных задач біямедыцынскага характару, у біяінжынерных распрацоўках, пры эксперыментальным мадэляванні развіцця паталагічных станаў. Асаблівасцю эксперыментальнай працы з культывіраванымі нейронамі з’яўляецца неабходнасць аналізу малюнкаў не толькі цел клетак, але і складанай сеткі атожылкаў – нейрытаў. Для падліку колькасці клетак у завісі пры правядзенні работ па клеткавым культывіраванні часта выкарыстоўваюцца класічныя падыходы з камерай Гараева дзякуючы іх шырокай распаўсюджанасці і простым методыкам працы, заснаваным на ручным падліку клетак. У цэлым апрацоўка малюнкаў клетак – гэта працаёмкая працэдура, якая патрабуе канцэнтрацыі ўвагі і спалучаная з памылкамі пры вялікіх аб’ёмах работ. Разам з тым у цяперашні час інтэнсіўна развіваюцца метады нейрасеткавай апрацоўкі малюнкаў, якія паспяхова прымяняюцца для распазнавання розных біялагічных аб’ектаў. У сувязі з гэтым актуальнай з’яўляецца распрацоўка метадаў аналізу малюнкаў клетак нервовай тканіны, атрыманых метадамі светлавой мікраскапіі, якія дазваляюць праводзіць даследаванні дынамікі жывых культур клетак, якія развіваюцца. Перспектыўныя падыходы ў гэтым напрамку звязаны з выкарыстаннем сучасных метадаў машыннага навучання, у тым ліку метадаў глыбокага навучання, якія прыдатныя для працы са складанымі і зашумленымі малюнкамі. Так, архітэктура нейроннай сеткі U-Net, якая рэалізуе метад глыбокага навучання, паказала добрыя вынікі пры апрацоўцы малюнкаў біялагічных аб’ектаў.
У дадзенай працы прадстаўлены падыходы да сегментацыі фазакантрастных малюнкаў культываваных нейронаў кары галаўнога мозгу пацука, а таксама падліку клетак у камеры Гараева з ужываннем нейрасеткавых метадаў глыбокага навучання.
Матэрыялы і метады клеткавых работ
Нейроны кары галаўнога мозгу пацука вылучалі ў адпаведнасці з нормамі этычнага абыходжання з эксперыментальнымі жывёламі. Дысацыяваныя нейроны высейвалі ў кубкі Петры Nunclon Nunc (Thermo Fisher Scientific, ЗША) у культуральную сераду Neurobasal з дабаўкай B-27 (Thermo Fisher Scientific, ЗША) і змяшчалі ў клеткавы CO2-інкубатар пры тэмпературы 37 ℃, утрыманне СО2 у інкубатары складала 5%. Малюнкі нейронаў атрымлівалі пры дапамозе мікраскопа Nikon Eclipse Ti2-U (Японія) у рэжыме фазавага кантрасту шляхам аўтаматычнага сканіравання зададзенай вобласці.
Для атрымання малюнкаў завісі клетак у камеры Гараева выкарыстоўвалі лінію гліёмы пацука C6. Малюнкі атрымлівалі праз мікраскоп BestScope BS-2092 з усталяванай лічбавай камерай ToupCam UCMOS05100KPA.
Рэалізацыя метадаў апрацоўкі малюнкаў
Для папярэдняй апрацоўкі атрыманых малюнкаў нейронаў ужывалі распрацаваны набор модуляў на мове Python з дапамогай бібліятэкі OpenCV. Акрамя перадапрацоўкі даных, малюнкі з навучальнай выбаркі праходзілі этапы аўгментацыі, якія ўключаюць адлюстраванне ад восі, кручэнне малюнка, размыццё вобласці, змяненне яркасці малюнка.
Для вырашэння задачы сегментацыі была мадыфікавана мадэль MEDIAR-Former, распрацаваная на аснове архітэктуры U-Net. Яна ўлічвае неабходнасць апрацоўкі гетэрагенных набораў малюнкаў, якія атрыманы метадамі аптычнай мікраскапіі. Структура MEDIAR-Former у агульным выглядзе складаецца з блокаў кадавання, дэкадавання і двух незалежных выходных блокаў распазнання клетак (CR) і падзелу клетак (CD). Дадзеная мадэль была мадыфікавана шляхам дадання блокаў класіфікацыі клетак (CC) і сегментацыі нейрытаў (NS).
У якасці метрыкі выніковасці выкарыстоўвалі F1-меру як сярэдняе гарманічнае паміж дакладнасцю і паўнатой, дзе дакладнасць – стаўленне колькасці праўдзіва-станоўчых вынікаў да сумы колькасці праўдзіва-станоўчых і прытворнададатных вынікаў, а паўната – стаўленне колькасці праўдзіва-станоўчых вынікаў да сумы колькасці праўдзіва-станоўчых і ліжываадмоўных вынікаў.
Для разліку колькасных паказчыкаў даўжыні нейрытаў выкарыстоўвалі аперацыю шкелетаіанізацыі бінарнай маскі, у выніку чаго атрымлівалі набор ліній, для якіх разлічвалі даўжыню. Для стварэння навучальных набораў даных выконвалі ручную сегментацыю даных на адпаведныя класы.
У якасці пачатковага стану выкарыстоўвалі набор вагаў, атрыманы ў выніку навучання з ужываннем шэрагу адкрытых баз даных малюнкаў культываваных клетак, для якога затым праводзілі данавучанне з дапамогай атрыманых малюнкаў культываваных нейронаў і адпаведных масак, атрыманых у выніку ручнога сегментавання.
Для распазнання клетак гліёмы С6 на малюнках камеры Гараева ўзялі нейрасеткавую мадэль на аснове архітэктуры U-Net c прагназаваннем вертыкальных і гарызантальных градыентаў аб’ектаў. Для распазнання выкарыстоўвалі базавы набор вагаў, атрыманы ў выніку навучання нейроннай сеткі на наборы малюнкаў клетак з розных крыніц, а таксама набор вагаў, атрыманы ў выніку данавучання пасля ручной сегментацыі малюнкаў клетак С6 ў камеры Гараева пры павелічэнні 10х і 20х. У якасці мер эфектыўнасці распазнання ўжывалі: дакладнасць А як стаўленне колькасці правільна распазнаных аб’ектаў да памеру навучальнай выбаркі; дакладнасць P як стаўленне колькасці праўдзіва-станоўчых вынікаў да сумы колькасці праўдзіва-станоўчых і прытворнададатных вынікаў; паўнату R як стаўленне колькасці праўдзіва-станоўчых вынікаў да сумы колькасці праўдзіва-станоўчых і ілжываадмоўных вынікаў.
Вынікі і абмеркаванне
Распрацаваны метад аналізу малюнкаў нейронаў апрабіраваны пры характэрызацыі развіцця сеткі культываваных нейронаў in vitro на аснове падліку даўжыні нейрытаў на розных стадыях росту культуры. Атрыманая залежнасць разлічанай сумарнай даўжыні нейрытаў на адным квадратным міліметры паверхні пры ручной сегментацыі адпавядае залежнасці для ручной сегментацыі, але разлічаныя значэнні даўжыні менш, так як алгарытм распазнае не ўсе нейрыты, вызначаныя пры ручной апрацоўцы. Пры сегментацыі тэставай выбаркі былі атрыманы наступныя значэнні F1-меры: для клетак і кластараў F1=0,688, для нейрытаў F1=0,609. Для зыходнай мадэлі Mediar без данавучання пры класіфікацыі клетак атрымана значэнне F1=0,215. Такім чынам, данавучанне на атрыманых фотаздымках культываваных нейронаў дазволіла істотна палепшыць прадукцыйнасць сегментацыі нейронаў.
Пры падліку клетак на малюнках камеры Гараева пры павелічэнні 20х дакладнасць A склала 0,925 пры распазнанні з базавым наборам вагаў і 0,965 пры распазнанні пасля данавучання. Пры павелічэнні 10х пры распазнанні з базавым наборам вагаў атрыманы значэнні: A=0,794, P=0,962 і R=0,892. Пры павелічэнні 10х пры распазнанні пасля данавучання атрыманы значэнні: A=0,981, P=0,994 і R=0,986. Такім чынам, працэдура данавучання пасля ручной сегментацыі дазволіла павысіць прадукцыйнасць распазнання клетак. Эфектыўнасць распазнавання малюнкаў пры павелічэнні 10х знізілася ў параўнанні з малюнкамі пры павелічэнні 20х у сувязі са зніжэннем ступені дэталізацыі аб’ектаў. Далейшае развіццё прадстаўленага падыходу будзе накіравана на працу з малюнкамі, атрыманымі пры павелічэнні 4х, якія захопліваюць поўны сегмент камеры Гараева, што дазволіць праводзіць падлік клетак па адной фатаграфіі і значна паскорыць працу ў параўнанні з ручным метадам. Пры наборы адпаведных баз даных магчымы аналіз малюнкаў афарбаваных клетак, а таксама дэтэкцыя розных тыпаў клетак на аснове іх марфалагічных асаблівасцяў.
Атрыманыя значэнні F1-меры пры распазнанні нейрытаў можна параўнаць са значэннямі для распазнання клетак, што сведчыць аб эфектыўнасці працы абранай нейрасеткавай мадэлі пры распазнанні нейрытаў у параўнанні з класічнымі метадамі, заснаванымі на дэтэкцыі з ужываннем парога інтэнсіўнасці. Для павышэння эфектыўнасці распазнання будуць праводзіцца данабор базы даных малюнкаў культываваных нейронаў, якія выкарыстоўваюцца для навучання нейроннай сеткі, а таксама мадыфікацыя архітэктуры для паляпшэння працы з працяглымі аб’ектамі. Далейшае развіццё распрацаваных сродкаў аналізу таксама можа быць накіравана на падзел распазнаных клетак на класы па марфалагічных прыкметах, напрыклад, нейроны і гліяльные клеткі, пры фарміраванні адпаведнай базы даных малюнкаў. На аснове атрыманых у выніку сегментацыі масак магчыма правядзенне падліку колькасці клетак на падкладцы, ступені іх адгезіі да субстрату, марфалагічнага даследавання арбарызацыі нейрытаў і іншых відаў аналізу. Атрыманыя вынікі могуць прымяняцца пры адпрацоўцы новых эксперыментальных методык вырошчвання нейронаў, у тым ліку на новых тыпах субстратаў, для колькаснага маніторынгу прымацавання і адгезіі клетак, росту нейрытаў.
Распрацаваныя метады могуць прымяняцца і для аналізу малюнкаў, што атрымліваюцца пры правядзенні іншых тыпаў эксперыментаў з культываванымі клеткамі, напрыклад, пры даследаванні працэсаў дыферэнцыявання ствалавых клетак у нейранальным кірунку, пры распрацоўцы біяінжынерных канструкцый для мадэлявання працэсаў рэгенерацыі нервовай тканіны, для выяўлення паталагічных фенатыпаў клетак на малюнках, пры працы з эксперыментальнымі сістэмамі на аснове арганоідаў, якія мадэлююць працэсы развіцця нервовай сістэмы.
